Implementing the CRISPR-Cas9 technology in Eucalyptus hairy roots and functional characterization of auxin-dependent transcription factors involved in wood formation
Mise au point de la technologie CRISPR-Cas9 dans des racines " hairy root " d'Eucalyptus grandis et caractérisation fonctionnelle de facteurs de transcription de la signalisation auxinique potentiellement impliqués dans la formation du bois
Résumé
Eucalyptus is the most planted hardwood worldwide for many industrial end-uses such as pulp and paper and emerging biofuel production. The analysis of the Eucalyptus grandis genome led to many candidate genes involved in wood formation including key mediators of auxin signaling (Auxin/Indole-3-Acetic Acid (Aux/IAA) and Auxin Response Factor (ARF). The functional characterization of these candidate genes was hampered by the difficulty to general stable transgenic Eucalyptus and to knock out these genes. Taking advantage of rapid and efficient hairy root transformation mediated by A.rhizogenes, recently implemented by our team, the objectives of my work were to implement the powerful CRISPR/Cas9 gene editing tool and to use it to investigate the potential roles of three Eucalyptus auxin-dependent transcription factors (IAA9A, IAA20 and ARF5) in regulating wood formation. First, as a proof-of-concept for implementing CRISPR/Cas9, We targeted Cinnamoyl-CoA Reductase1 (CCR1), a key lignin biosynthetic gene whose down-regulation effects are well described in several plants. Almost all transgenic lines were edited but the allele-editing rates and profiles varied greatly depending on the genes targeted. Most edition events generated truncated proteins. The prevalent edition types were small deletions but large deletions were also observed. By using a combination of Fourier Transformed InfraRed (FT-IR) spectroscopy and multivariate analysis (partial least square analysis (PLS-DA), we showed that the CCR1-edited lines, which were clearly separated from the controls. The most discriminant wave-numbers were attributed to lignin. Histochemical analyses further confirmed the decreased lignification and the presence of collapsed vessels in CCR1-edited lines, which are characteristics of CCR1 deficiency. Although the efficiency of editing could be improved, the method described here is already a useful tool to functionally characterize eucalypts genes. In the second part of my work, we used this genome editing method to knock out two Aux/IAAs (IAA9A and IAA20) and one Auxin Response Factor (ARF5) in order to get more insights into the role of auxin in the regulation of wood formation in Eucalyptus. We generated transgenic Eucalyptus hairy root to overexpress and to knock out these genes. Unfortunately, all the transgenic plants overexpressing IAA9A and IAA20 (under the control of 35S promoter) died during the Covid19 lockdown period and only three IAA20-CRISPR lines survived. Therefore, we could only analyze CRISPR/Cas9 edited transgenic plants for two candidates (IAA9A and ARF5). Editing events were detected either by subcloning and/or webbased tools (DSDecode and ICE synthego). CRISPR/Cas9 generated IAA9A_lines had high knockout rates of 92.3% with 58.3% of biallelic mutations. In contrast, ARF5 lines had quite low editing rates (43%) showing monoallelic and chimera mutations. [...]
Les Eucalyptus sont les feuillus les plus plantés au monde pour les nombreuses utilisations industrielles de leurs bois tells que la pâte à papier et la production émergente de biocarburants. L'analyse du génome d'Eucalyptus grandis a conduit à l'identification de nombreux candidats impliqués dans la formation du bois, tells que des médiateurs clés de la signalization de l'auxine (Aux/IAA et Auxin Response Factor (ARF). La caractérisation fonctionnelle de ces gènes candidats a été retardée jusqu'à présent par la difficulté de supprimer leurs fonctions dans un système homologue. Pour pallier à cela, le premier objectif de mon travail a été de mettre au point le puissant outil d'édition de gènes "CRISPR/Cas9" en profitant de la transformation de "hairy roots" transgéniques médiée par A. rhizogenes, récemment développée dans l'équipe. Dans un deuxième temps, mon objectif était d'utiliser cette méthode d'édition de génome pour étudier les rôles potentiels de trois facteurs de transcription dépendant de l'auxine (IAA9A, IAA20 et ARF5) dans la formation du bois d'Eucalyptus. Premièrement, comme preuve de concept pour la mise en oeuvre de la technologie CRISPR/Cas9, nous avons ciblé la Cinnamoyl-CoA réductase1 (CCR1), un gène clé de la biosynthèse de la lignine dont les effets de "down-regulation" sont bien connus. Nous avons également utilisé le gène IAA9A comme cible. Presque toutes les lignées transgéniques ont été éditées, mais les taux et les profils d'édition alléliques variaient considérablement selon le gène ciblé. La plupart des événements d'édition ont généré des protéines tronquées. En utilisant une combinaison de spectroscopie à infrarouge transformée de Fourier (FT-IR) et d'analyse multivariée (PLS-DA), j'ai pu montrer que les lignées éditées pour CCR1, étaient clairement séparées des témoins. Les analyses histochimiques ont confirmé la diminution de la lignification et la présence de vaisseaux écrasés dans les lignées éditées pour CCR1, qui sont des caractéristiques de la déficience de ce gène. Bien que l'efficacité de l'édition puisse être améliorée, la méthode décrite ici est déjà un outil utile pour caractériser fonctionnellement des gènes chez l'Eucalyptus. Dans la deuxième partie de mon travail, j'ai utilisé cette méthode d'édition du génome pour muter deux Aux/IAAs (IAA9A et IAA20) ainsi que ARF5 afin de mieux appréhender le rôle de l'auxine dans la régulation de la formation du bois chez l'Eucalyptus. J'ai généré des "hairy roots" soit pour surexprimer ces gènes, soit pour les muter par CRISPR/Cas9. Malheureusement, toutes les plantes transgéniques surexprimant IAA9A et IAA20 (sous le contrôle du promoteur CaMV35S) sont mortes pendant la période de confinement liée au Covid19 et seules trois lignées CRISPR-IAA20 ont survécu. Par conséquent, je n'ai pu analyser que des plantes transgéniques éditées pour deux candidats. Les lignées IAA9A générées par CRISPR/Cas9 présentaient des taux de knock-out élevés de 92,3% avec 58,3% de mutations bialléliques. En revanche, les lignées ARF5 avaient des taux d'édition assez faibles (43%) et des mutations monoalléliques et/ou chimériques.[...]
Origine : Version validée par le jury (STAR)