"Utilisation de sondes pyréniques in vivo pour caractériser l'état de phase global de la membrane plasmique de cellules eurcaryotes". Application à la détection de la liaison d'agonistes au recepteur et opioide murin.
Résumé
The development of tools for the screening of new receptors' agonists is a major issue for pharmaceutical research. Currently, the main targets used are the G-protein coupled receptor of the plasma membrane which the activation trigger the signaling pathways involved in many cell functions. The goal of this thesis is the detection, using a spectrofluorometry approach in vivo, of the signaling pathway ignition by the mouse delta opioid receptor (mDOR). DOR is assumed to generate a relocalisation of some lipids (cholesterol) while agonist binding leading to the formation of a liquidordered phase (lo). Thus two fluorescent probes have been synthesized, which the 3beta-hydroxypregn- 5-ene-21-(1-methylpyrenyl)-20-methylidene. Data from calorimetry and RMN-2H studies show that this probe induces the same lipid membranes disturbance than cholesterol. Absorption data of the probe allowed the assessment of a self-association process of cholesterol in model membranes, which is as a function of the acyl-chains saturation degree of phospholipids. Then the polarity sensitive property of the probe has been used to distinguish between ld and lo phases in model membranes. Finally, we incorporated the probes in CHO cells over-expressing mDOR to monitor, by fluorescence spectroscopy, the mean phase state change of the plasma membrane triggered by a mDOR agonist. This is the first step of a new screening approach.
Le développement d'outils performants de criblage de nouvelles molécules capables d'induire une réponse cellulaire identique à celle d'un ligand (agoniste/ antagoniste, etc...), est un enjeu important pour la recherche pharmaceutique. Les principales cibles utilisées aujourd'hui sont les récepteurs trans-membranaires couplés aux protéines G (RCPG), dont l'activation déclenche une cascade de réactions intracellulaires (signalisation) régulant des fonctions essentielles de la cellule. L'objectif de ce travail de thèse est la détection de l'initiation de la signalisation cellulaire par spectrométrie de fluorescence pour le récepteur d opioïde murin (mDOR) qui induit un changement conformationnel responsable d'un épaississement de sa partie transmembranaire lors de la signalisation, au niveau de la membrane plasmique de cellules eucaryotes in vivo. Ce changement est supposé générer des modifications de phase lipidique de la membrane plasmique lors de cette interaction RCPG/agoniste, avec des redistributions locales de certains lipides comme le cholestérol, conduisant à la génération d'une phase liquide-ordonnée (lo). Pour cela deux nouvelles sondes fluorescentes membranaires de la famille des Pyrènecholestérol ont été synthétisées, le 3b-hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-one 1 et le 3b- hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-méthylidène 2. Dans un premier temps la comparaison du comportement de ces sondes vis-à-vis du cholestérol a été analysée dans différentes membranes modèles phospholipidiques. Les données de microcalorimétrie et de RMN-2H indiquent que ces composés induisent des perturbations des lipides comparables à celle du cholestérol. Les données d'absorption, combinées à la propriété hypochromique du chromophore pyrène, ont permis de mettre en évidence un comportement autoassociatif de ces sondes. Nous extrapolons ce résultat à celui du cholestérol car des simulations en dynamique moléculaire déduisaient cette même associativité. Nous retrouvons qu'elle augmente avec le degré d'insaturation des chaînes acyles et qu'elle diminue quand la quantité de cholestérol croît (plus grande miscibilité des sondes dans les membranes enrichies en cholestérol). Dans un deuxième temps la sensibilité du spectre d'émission de fluorescence à la polarité de l'environnement a été vérifiée et mise à profit dans des membranes modèles pour discriminer les membranes en phase ld de celles en phase lo (où la polarité du coeur de la membrane est plus faible). Enfin, l'incorporation de la sonde 2 dans la membrane plasmique de cellules vivantes CHO qui sur-expriment mDOR, a permit le suivi dans le temps, par spectrofluorimétrie et microspectrofluorimétrie, de la perturbation de phase induite par un agoniste de ce récepteur. Les bases d'un criblage sélectif sont donc posées.