New approaches to study the architecture and dynamics of the sealing zone in osteoclasts
Nouvelles approches pour l'étude de l'architecture et la dynamique de la sealing zone des ostéoclastes
Résumé
Bone is a complex biological environment, and a living tissue under constant renewal throughout life. Its remodeling process is orchestrated by three different cell types: osteoblasts, osteoclasts and osteocytes. While osteoblasts are in charge of the generation of new bone matrix, the main function of osteoclasts is to degrade it, and both activities are under the regulation of osteocytes. In order to efficiently dissolute both mineralized and organic bone components, osteoclasts compartmentalize their plasma membrane to create a resorption microenvironment. The ruffled border is the site of extensive vesicular trafficking, and the sealing zone confines the digestion site. The sealing zone has been identified in the late 80s as a dense actin structure, then in the late 2000s as composed of seemingly podosomal subunits. However, little is still known about the precise inner organization of this specific cytoskeletal arrangement. This study proposed the first quantitative nanoscale characterization of the sealing zone in human osteoclasts. It benefited from state-of-the-art super-resolution microscopy, compatible with observation of both fixed and live samples on bone. Hence, it also yielded the first assessment of the internal dynamics of single actin cores within the sealing zone. It provided the precise in-plane localization of major actin-binding proteins associated with the sealing zone. In addition, it evaluated the 3D distribution of the same proteins in the podosome belt, counterpart of the sealing zone on glass substrates. In contrast to podosomes, the mechanical properties of the sealing zone have been but poorly investigated. Thus, this work also aimed at developing a new traction force microscopy environment, allowing for 3D characterization of forces thanks to a 3D nanoscopy technique. The acute sensitivity of the observation method implied challenging technological requirements, the feasibility of which have been explored. Even if this project was not successfully achieved, it helped identifying key information in order to raise technological bolts in the future. In addition, micro- and nanotechnological resources have been applied to the development of new substrates to assess topography sensing at the nanoscale. Indeed, micron-sized lines presenting nanoscale heights were directly shaped on glass coverslips thanks to photolithography and chemical etching, and their characterization was carried out with atomic force microscopy. [...]
L'os forme un environnement cellulaire complexe, et est sujet à un renouvellement constant tout au long de l'existence. Son remodelage dépend de trois types cellulaires : les ostéoblastes, les ostéoclastes et les ostéocytes. Le rôle des ostéoblastes consiste en la construction de la nouvelle matrice osseuse, tandis que les ostéoclastes sont responsables de sa dégradation. Tout ceci se fait sous la régulation des ostéocytes. Afin de pouvoir efficacement dissoudre les parties minérales et organiques de l'os, les ostéoclastes mettent en place des domaines spécifiques de leur membrane plasmique. Cette polarisation leur permet de créer un microenvironnement confiné, favorable à la résorption. Elle est caractérisée par la formation d'une zone membranaire fortement convoluée (" ruffled border ") où le trafic vésiculaire est intense, qui est entourée d'une zone de scellement ou " sealing zone ". La sealing zone, en tant que structure à forte densité d'actine, a été caractérisée à la fin des années 80, et une vingtaine d'années plus tard des sous-unités ressemblant à des podosomes ont été identifiées à l'intérieur de cette entité. Les podosomes sont des structures d'adhérence, de taille caractéristique inférieure au micron, et présents dans les cellules hématopoiétiques. De plus, leur structure a été largement documentée à l'aide de nombreuses techniques de microscopie de super-résolution. A l'inverse, l'organisation interne de la sealing zone reste encore aujourd'hui peu décrite à une telle échelle. Au cours de cette étude, une première caractérisation quantitative à l'échelle nanoscopique de la sealing zone des ostéoclastes humains a été proposée. A l'aide d'une technique de microscopie de super-résolution de pointe, compatible avec l'observation de cellules sur os, des acquisitions sur échantillons fixés et vivants ont pu être réalisées. Ceci a notamment permis de mettre en évidence des évènements dynamiques au sein même des cœurs d'actine dans la sealing zone, jusque-là inconnus. Certaines protéines majeures de la sealing zone ont également pu être localisées en 2D. De plus, une étude de la ceinture de podosomes, homologue sur verre de la sealing zone, a permis d'établir les distributions 3D des mêmes protéines grâce à une technique de nanoscopie. Contrairement aux podosomes individuels, la mécanobiologie de la sealing zone est un domaine encore peu exploré. Ainsi, une autre partie de ce projet a été dédiée au développement d'un nouveau protocole de microscopie de force de traction. Cette alternative visait à permettre la caractérisation de forces en 3D, bénéficiant d'une très bonne résolution grâce à la technique d'observation choisie. Le travail s'est concentré sur l'évaluation de la faisabilité d'une telle méthode, compte tenu du cahier des charges imposé par l'usage de nanoscopie 3D.[...]
Origine : Version validée par le jury (STAR)