Involvement of matrix and cell components of bacterial biofilms models in response to physical treatments : analysis tools standardization and application to cold plasma jet and UV-C LEDs technologies
Implication des composantes matricielle et cellulaire de biofilms bactériens modèles en réponse à des traitements physiques : standardisation d'outils d'analyse et application aux technologies jet de plasma froid et LED UV-C
Résumé
Bacterial biofilms are an issue in several sectors such as health, agri-food and industry. Biofilms are composed of a community of microorganisms attached to a surface, and maintained and protected by an extracellular matrix of different bio-polymers. Conventional biofilm eradication methods involve the use of chemical or thermal treatments. More recently, new physical techniques with lower environmental impacts such as cold plasma jets and light emitting diodes (LED) emitting in the UV, have been studied for the decontamination/sterilization of surfaces. Due to the structural complexity of biofilms and the diversity of physical parameters of the device, developing such innovative and sustainable technologies for anti-biofilm applications require major methodological improvements in order to correctly quantify or qualify their biological effects. In this study, two bacterial strains exposing different parietal and extracellular matrix characteristics were chosen: Leuconostoc citreum NRRL B-1299 (Gram +, controllable production of an exopolysaccharide matrix) and Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 (Gram-, protein and e-DNA rich complex matrix). The treatment devices involved the use of a prototype cold plasma jet able to generate reactive nitrogen species (RNS) and oxygen (ROS), and a home-made LED device emitting in the UVC at 280 nm. Firstly, a methodology was defined to obtain reproducible and standardized surface biofilms (on membranes) in terms of cell density and extracellular matrix. The biocidal effect of UV-C LED applications and plasma jet treatments were measured by conventional bacterial counts, and comparing values between membrane-deposited cells and 24-hour grown biofilms. The results of the plasma jet treatment suggested that the extracellular matrix had a protective role and this in relation to its biochemical composition (amount and composition of the bio-polymers). In the case of UV- C LED treatment, and in relation to the absorbance properties of the matrix components, the protective effect of the matrix was demonstrated only for P. aeruginosa. Another feature of this work has been the exploitation of methods to more accurately assess the effects of the physical treatments on the cellular compartment of biofilms. The qPCR viability method (or PMA / EMA-qPCR) did not lead to satisfactory quantifications of P. aeruginosa or L. citreum cells. In contrast, a method based on metabolic reduction of resazurin by cells could be proposed. This study highlights the importance of considering cell density and characterizing extracellular matrix compounds when evaluating bacterial biofilm eradication methods, and moreover underlines the need to further develop analytical tools adapted to this problematic.
Les biofilms bactériens posent de nombreux problèmes dans les domaines de la santé, de l'agro-alimentaire et de différents secteurs industriels. Un biofilm est une communauté de microorganismes fixés à une surface, maintenus et protégés par une matrice extracellulaire constituée de différents polymères. L'éradication de ces biofilms passe traditionnellement par l'utilisation de traitements chimiques ou thermiques. Récemment, des techniques physiques à faible impact environnemental tels que les jets de plasma froid et les diodes électroluminescentes (LED) émettant dans les UV ont été étudiées pour la décontamination/stérilisation de surfaces. Du fait de la complexité structurale des biofilms et de la diversité des paramètres physiques de ces dispositifs, l'essor de ces technologies innovantes et durables pour des applications anti-biofilms demandent de nombreuses améliorations méthodologiques permettant la quantification ou la qualification de leurs effets biologiques. Lors de cette étude, deux souches bactériennes ayant des caractéristiques pariétale et matricielle différentes ont été choisies : Leuconostoc citreum NRRL B-1299 (Gram+, production contrôlable d'une matrice exopolysaccharidique) et Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 (Gram-, matrice complexe riche en protéines et ADN). Les systèmes physiques utilisés correspondent à un prototype de jet de plasma froid qui génère des espèces réactives de l'azote (RNS) et de l'oxygène (ROS) et à un dispositif LED émettant dans les UV-C à 280 nm. Dans un premier temps, une méthodologie a été définie afin d'obtenir des biofilms aériens (sur des membranes) de façon reproductible et standardisée en termes de densité cellulaire et de matrice extracellulaire. L'effet biocide des traitements LED UV-C et jet de plasma appliqués, évalué par dénombrement bactérien classique, a été comparé entre des cellules déposées sur membrane et des biofilms de 24 heures. Les résultats du traitement au jet de plasma ont permis d'émettre l'hypothèse d'un rôle protecteur de la matrice extracellulaire, en lien avec sa composition (quantité et nature des polymères). Dans le cas du traitement LED UV-C, et en lien avec les propriétés d'absorbance des composants matriciels, l'effet protecteur de la matrice a été démontré pour P. aeruginosa. Un autre aspect de ces travaux a concerné l'exploitation de méthodes permettant d'évaluer de façon plus précise les effets des traitements physiques sur la composante cellulaire des biofilms. La méthode qPCR de viabilité (ou PMA/EMA-qPCR) n'a pas permis d'aboutir à une quantification satisfaisante des cellules de P. aeruginosa ou de L. citreum. En revanche, une méthode basée sur la réduction métabolique de la résazurine par les cellules a pu être proposée. Ces études contribuent à renseigner sur l'importance du paramètre de densité cellulaire et de caractérisation de la matrice extracellulaire dans l'évaluation de méthodes physiques d'éradication des biofilms bactériens et soulignent la nécessité de continuer à développer des outils d'analyses adaptés à cette problématique.
Origine : Version validée par le jury (STAR)