Membrane events of the signal transduction by a G protein coupled receptor: dynamic organisation of the human mu opioïd receptor at the surface of neuroblastoma cells.
Etapes membranaires de la transduction du signal par les récepteurs couplés aux protéines G : organisation dynamique du récepteur mu aux opioïdes humain à la surface de neuroblastomes.
Résumé
We address the question of the existence of a specific membrane organization which could favor the interactions between the G protein coupled receptor (GPCR), the G protein and the effector. Here we examine the lateral diffusion of the human mu opioid receptor (hMOR) in regard to its activation by ligands and to membrane environment modifications. The T7-EGFP-hMOR stably expressed in SH-SY5Y is found to be fully functional. Its mobility analysis was achieved using two complementary biophysical approaches which are vrFRAP (variable radii fluorescence recovery after photobleaching) and SPT (single particle tracking). At 22°C these analyses reveal a double compartimentation of the receptors in permeable domains (about 1 µm radius) and in smaller domains (200 nm radius). Moreover receptors exhibiting a directed diffusion are observed. The temperature was modulated, the actin cytoskeleton was partially destroyed, and the G protein/receptor interaction was impeded to determine the sources of the receptor organisation. It appears that many parameters are playing a part in the complex receptor organisation. Our results show that the interactions of hMOR with G proteins or with the cortical cytoskeleton influence its membrane organisation. Antagonists binding don't modify the receptor organisation in permeable sub-micrometer size domains. On the contrary agonists binding induce a decrease of both the domain size and the diffusion coefficient. Our results highlight the influence of numerous parameters on the hMOR dynamic organisation. They demonstrate the interest of a conjoint use of vrFRAP and SPT approaches to obtain a global vision of a protein plasma membrane organisation.
La question se pose de l'existence de domaines membranaires permettant de regrouper les différentes protéines nécessaires à la transmission du signal par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Nous avons donc analysé l'organisation dynamique du récepteur mu opioïde humain (hMOR) en relation avec ses paramètres pharmacologiques et les contraintes de son environnement. Après avoir vérifié la fonctionnalité de T7-EGFP-hMOR dans les SH-SY5Y, sa dynamique latérale a été étudiée par retour de fluorescence après photoblanchiment à rayon variable (FRAPrv) et par suivi de particule unique (SPT). A 22°C ces analyses ont révélé une double compartimentation des récepteurs : dans des domaines perméables de près de 1 µm de rayon et dans des domaines de rayon inférieur à 200 nm. De plus, près d'un tiers des récepteurs présente une diffusion dirigée. Les effets de la variation de température, de la déstabilisation du cytosquelette d'actine et du blocage de l'interaction protéine G/récepteur ont été observés afin de mieux comprendre l'origine de ces domaines. Bien que tous les paramètres qui y participent ne soient pas encore déterminés, les résultats indiquent que les protéines G ainsi que le cytosquelette influencent l'organisation membranaire de hMOR. La fixation d'antagonistes ne modifie pas la diffusion du récepteur. Au contraire celle des agonistes entraînent une diminution de la taille des domaines et un ralentissement des récepteurs en lien avec la transmission du signal et l'internalisation. Nos résultats soulignent l'importance de plusieurs paramètres sur l'organisation dynamique de hMOR et confortent l'intérêt de l'utilisation conjointe du FRAP et du SPT.